現(xiàn)代社會壓力使人類的作息時間很難嚴(yán)格遵循于體內(nèi)的生物鐘。加班、輪班，頻繁地跨越時區(qū)，熬夜玩手機(jī)等等，越來越多人都面臨著生物鐘紊亂的困擾，因此研究節(jié)律對于現(xiàn)代與未來的社會有著非同尋常的意義。

　　我們都知道經(jīng)常熬夜，生活不規(guī)律的人經(jīng)常會出現(xiàn)很多精神問題，諸如脾氣暴躁、社交障礙等等，然而傳統(tǒng)上基于小鼠等動物模型的研究很難如實反映這些癥狀。但由于之前上對非人靈長類的基因編輯非常困難，因此對節(jié)律在這方面的研究也長期進(jìn)展緩慢。

　　為此，中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所的生物節(jié)律與衰老疾病研究組和非人靈長類研究平臺經(jīng)過兩年努力，利用CRISPR/Cas9方法，成功構(gòu)建了世界首例核心節(jié)律基因BMAL1敲除獼猴模型，仔細(xì)驗證后發(fā)現(xiàn)了敲除猴模型存在晝夜節(jié)律紊亂，并表現(xiàn)出類似精神分裂癥的癥狀。

　　晝夜節(jié)律（生物鐘）調(diào)節(jié)人體諸多行為

　　哺乳動物的生物鐘包括中樞生物鐘和外周生物鐘。大腦的生物鐘不僅調(diào)控著我們睡眠-覺醒周期，也調(diào)節(jié)著諸多行為。外周生物鐘受到中樞生物鐘調(diào)控，同時也受進(jìn)食、溫度等因素的影響。衰老、長期熬夜、時差、肥胖或癌癥等原因可能會導(dǎo)致外周生物鐘與中樞生物鐘不同步。晝夜節(jié)律紊亂與代謝綜合征、自身免疫、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等疾病密切相關(guān)。

　　在哺乳動物的大腦中有一個控制生物節(jié)律的“起搏器”，它是位于下丘腦的視交叉上核。視交叉上核根據(jù)自然界光-暗周期調(diào)控生理和活動節(jié)律，并能通過激素和神經(jīng)信號調(diào)節(jié)外周生物鐘，損毀視交叉上核的動物晝夜節(jié)律會完全消失。這個“起搏器”則是通過一系列節(jié)律基因調(diào)控晝夜節(jié)律，這些核心節(jié)律基因之一便是BMAL1。

　　BMAL1蛋白會與另一個蛋白CLOCK形成異二聚體，并與其他節(jié)律相關(guān)基因結(jié)合，啟動這些基因的表達(dá)。隨著這些基因的表達(dá)產(chǎn)物逐漸增多，它們將進(jìn)入細(xì)胞核中，反過來抑制異二聚體的作用。如此循環(huán)，使基因的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)出24小時的振蕩周期。就是利用類似這樣原理的通路，我們的大腦才能有一個自發(fā)的24小時生物周期。

　　相對于小鼠的晝伏夜出和大腦結(jié)構(gòu)，獼猴更適合作為節(jié)律研究模型

　　大多數(shù)節(jié)律研究都是以小鼠為模式動物，可以用來深入探究節(jié)律的分子機(jī)制，但在轉(zhuǎn)化應(yīng)用方面，小鼠作為與人類生物節(jié)律相反的夜行性動物顯然不是特別合適。于是該研究團(tuán)隊想到了在進(jìn)化上與人類相近的非人靈長類，獼猴除了具有晝行性這一特性，在腦結(jié)構(gòu)和功能上與人類高度相似，可以用來研究腦疾病和高級認(rèn)知功能。隨著近年來神經(jīng)所新開發(fā)的縮短猴生殖周期技術(shù)的不斷優(yōu)化，以及體細(xì)胞克隆猴的實現(xiàn)，彌補(bǔ)了獼猴繁殖周期長，單胎數(shù)量少的不足，可以構(gòu)建出足夠數(shù)目的具有統(tǒng)一遺傳背景的動物模型。

　　BMAL1敲除猴表現(xiàn)出節(jié)律活動異常和睡眠紊亂

　　其實在2015年底，神經(jīng)所科研團(tuán)隊就曾經(jīng)利用CRISPR/Cas9方法，針對核心節(jié)律基因BMAL1進(jìn)行基因編輯，并在2016年中旬順利出生了5只基因編輯小猴。

　　那么這些猴子有沒有表現(xiàn)出周期紊亂的癥狀呢？

　　為此等到半年后小猴斷奶，研究人員就從多個方面開始觀察敲除猴的生物節(jié)律。研究人員給猴子們佩戴了“小米手環(huán)”，可以隨時監(jiān)測到它們的晝夜活動情況，發(fā)現(xiàn)敲除猴不再按照24小時的周期活動，在夜間活動明顯增多，這說明敲除猴可能出現(xiàn)了失眠的問題。于是研究人員通過手術(shù)，在猴子背部皮下埋入記錄腦電和肌電的植入子，分析其睡眠周期發(fā)現(xiàn)敲除猴的快速眼動睡眠（REM，淺睡期）和慢波睡眠（NREM，熟睡期）明顯減少。有趣的一點是，Bmal1敲除小鼠的睡眠相比正常對照則是增多的，這也進(jìn)一步提示了非人靈長類在腦疾病研究上的優(yōu)勢所在。在另一方面，研究人員通過搜集連續(xù)兩天多個時間點的血液樣本，對那些受節(jié)律調(diào)節(jié)的神經(jīng)內(nèi)分泌激素水平進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)幫助進(jìn)入睡眠的褪黑素在敲除猴中分泌較少。同時還進(jìn)行了血液分析，發(fā)現(xiàn)敲除猴的大多數(shù)節(jié)律基因表達(dá)異常，還有很多與睡眠剝奪，抑郁癥以及衰老等相關(guān)的基因上調(diào)。

　　節(jié)律紊亂猴的精神癥狀

　　當(dāng)然，之所以如此大費周章構(gòu)建基因敲除猴，研究者最期望在這些猴身上再現(xiàn)節(jié)律紊亂者的精神癥狀，這些才是非人靈長類較之小鼠等實驗動物的真正優(yōu)勢。研究人員給猴子們做了一個經(jīng)典的聽覺刺激實驗，在給出的一連串規(guī)律的聲音中隨機(jī)插入特殊的聲音，記錄猴子聽到聲音時的腦電，發(fā)現(xiàn)敲除猴大腦在識別和反應(yīng)這些特殊事件的能力上不如正常猴，這與精神分裂患者的情況類似。此外，有很多研究表明律紊亂或睡眠障礙還是一些精神疾病，如雙向情感障礙，抑郁癥，自閉癥譜系障礙的早期癥狀。但是之前我們很難認(rèn)定一只小鼠有抑郁或是雙向情感障礙之類的問題，而這在靈長類身上就很明顯了。研究人員在血液檢測中發(fā)現(xiàn)與壓力應(yīng)激相關(guān)的皮質(zhì)醇在敲除猴的血液中一直處于高水平，這讓他們聯(lián)想到敲除猴在與人接觸時極度緊張的反應(yīng)。當(dāng)有人靠近敲除猴時，它會雙手抱住頭部，蜷縮在角落里，不敢活動。如果將敲除猴放入一個新環(huán)境中，它也不能很快地適應(yīng)，不敢像正常猴那樣在環(huán)境中自由探索。

這只生物節(jié)律紊亂體細(xì)胞克隆猴有些焦躁不安

　　節(jié)律紊亂往往伴隨著神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，神經(jīng)退行性疾病患者往往會遭受各種各樣的睡眠問題，包括失眠、睡眠中斷、日間過度嗜睡，與人交流出現(xiàn)障礙等等。但在之前，人們一直不太清楚這些究竟是睡眠紊亂的直接后果，還是長期失眠或服藥的副作用。

　　中國科學(xué)家創(chuàng)建世界首例生物節(jié)律紊亂體細(xì)胞克隆猴模型

　　此次克隆猴和“中中”、“華華”有何區(qū)別

　　去年，世界首批克隆猴“中中”和“華華”的誕生標(biāo)志著非人靈長類體細(xì)胞克隆時代的到來。

　　不過需要注意的是，克隆“中中”和“華華”所使用的細(xì)胞來自流產(chǎn)胎猴的組織。那這有什么問題呢？

最大的生物節(jié)律紊亂體細(xì)胞克隆猴，總是沒有安全感地抱著頭。中科院神經(jīng)所提供

　　我們知道，克隆猴最大的意義之一在于我們可以由此批量制造基因編輯的猴子。而之前的“中中”和“華華”都是野生型的猴子，從疾病研究應(yīng)用價值上來說，不如基因編輯的猴子那么大。

“中中”、“華華”與本次研究所用的克隆猴流程示意圖�？茖W(xué)家會先去除猴卵細(xì)胞的細(xì)胞核，然后在其中放入另一只猴的體細(xì)胞核，等待兩者充分融合后，最后將這個核移植過的卵移植到代孕母猴體內(nèi)等待克隆猴出生。

　　除此以外，克隆的成功率與作為核供體的細(xì)胞有很大的關(guān)系。細(xì)胞和人一樣會在生長繁殖的過程中逐漸衰老，隨著細(xì)胞不斷分裂，其中會積累越來越多的DNA突變，細(xì)胞的質(zhì)量也會逐漸下降。

　　而“中中”、“華華”所用到的胎猴體細(xì)胞，本身就來自尚未出生的小猴，十分“年輕”，自然活力強(qiáng)。實際制作基因編輯猴所用的細(xì)胞比這要“年老”很多，更何況基因編輯本身還會對細(xì)胞的DNA造成一些損傷，所以我們一直會擔(dān)心，經(jīng)過這么一番折騰后，克隆的成功率會跌到多少。要知道“中中”、“華華”的克隆成功率尚不足1%，而克隆猴成本高昂，如果由此制造基因編輯猴的成功率太低，很可能就會因為成本問題而讓這項技術(shù)長期停留在紙面上，劉真表示。

　　因此我們非常需要真正利用體細(xì)胞核移植技術(shù)制造出基因編輯的猴子來實現(xiàn)這項技術(shù)。在工作開展之前，孫強(qiáng)等專家已經(jīng)通過直接向猴受精卵中注射CRISPR/Cas9的方法獲得了不太完美的BMAL1敲除獼猴，之所以說不完美，是由于部分基因敲除猴屬于“嵌合體”，體內(nèi)不同細(xì)胞的基因型有差異，因此在最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)亩�義上說還不算是理想的動物模型。

左圖為之前獲得的一只Bmal1基因敲除猴，它在本次實驗中提供了核供體細(xì)胞。右圖為從它體內(nèi)提取、培養(yǎng)的核供體細(xì)胞。

　　這次實驗制造出了5只基因敲除的克隆猴，從效率上說與當(dāng)初制造“中中”和“華華”的克隆實驗相當(dāng)，這在很大程度上打消了人們在效率上的擔(dān)憂。

本次研究得到的5只BMAL1敲除克隆猴

　　研究團(tuán)隊仔細(xì)檢測了這些克隆猴的細(xì)胞核基因型和線粒體基因型。如果是真的克隆動物，其細(xì)胞核的基因型一定和提供細(xì)胞核的那些細(xì)胞完全一致，而線粒體由于存在于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，不會隨著核移植一起轉(zhuǎn)移，因此一定和提供卵細(xì)胞的猴子完全一致。就目前而言，比對細(xì)胞核與線粒體基因就是驗證克隆動物的金標(biāo)準(zhǔn)。果不其然，這五只小猴的細(xì)胞核基因型與核供體細(xì)胞完全一致，而線粒體基因型則與卵供體猴一模一樣，同時它們的所有基因與生出它們的代孕媽媽則徹底無關(guān)，完全符合克隆動物的鑒定金標(biāo)準(zhǔn)。

有些頑皮的克隆猴

　　從本次的研究可以看到，猴子表現(xiàn)出怕人，避免與人對視等等精神問題，而這些癥狀是以前在小鼠身上很難探測到的。

　　可以說，本次研究意味著克隆基因編輯猴技術(shù)由此從理論層面邁向了實踐層面，鑒于目前克隆技術(shù)是制造基因編輯猴的成本最低、耗時最少的手段，而作為全球目前唯一掌握克隆猴技術(shù)的神經(jīng)所，有望在未來的神經(jīng)科學(xué)研究中搶先一步。非人靈長類的節(jié)律紊亂模型有望給節(jié)律研究帶來新的突破，我們在非人靈長類模型制備技術(shù)上的領(lǐng)先將轉(zhuǎn)化為整體基礎(chǔ)科研，尤其是神經(jīng)科學(xué)研究走向世界前列的歷史機(jī)遇。

　　該研究基于晝行性的非人靈長類動物模型，將生物節(jié)律與睡眠問題、精神疾病、免疫炎癥反應(yīng)、早衰等重大疾病聯(lián)系起來，既可為開發(fā)這些疾病的治療手段提供穩(wěn)固可靠的理論基礎(chǔ)，又可將其與臨床相結(jié)合尋求對人類更精準(zhǔn)有效的干預(yù)方法。

　　研究工作得到了中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項（B類）“腦認(rèn)知與類腦前沿研究”， 上海市市級科技重大專項“全腦神經(jīng)聯(lián)接圖譜與克隆猴模型計劃”，及上海市定向征集項目“腦神經(jīng)聯(lián)接圖譜研究”的支持。